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Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Karlsruhe

Lebensmittelüberwachung und Tiergesundheit im Regierungsbezirk Karlsruhe

Analytik von Permanent- und Tönungs-Haarfarben mittels HPLC-DAD

Permanente Haarfärbemittel enthalten Entwickler und Kuppler, von denen die wichtigsten aromatische Diamine, Aminophenole und mehrwertige Phenole sind. Sie kommen überwiegend in Haarfärbe-Cremes, selten auch in flüssigen Produkten vor.

Daneben gibt es direktziehende Tönungsfarben, die häufig in Mischung mit Oxidationshaarfarben angeboten werden. Die Analytik beruht auf der zügigen Isolierung der Farbstoff-Vorstufen und Farbstoffe mittels Ultraschallhomogenisator unter Oxidationsschutzbedingungen und anschließender Chromatographie mittels HPLC-DAD. Mit dieser Methode können 33 Haarfarben bestimmt werden.

Oxidationsbasen und Kuppler sind Verbindungen, die im Laufe der Probenaufarbeitung leicht abbauen können. Daher ist ein zügiger und unter Oxidationsschutz stattfindender Clean-up entscheidend für eine reproduzierbare Bestimmung mit guten Wiederfindungen. Aus der Literatur ist zu entnehmen, dass sowohl bei der bisher üblicherweise verwendeten HPLC-Methode nach Weyland (1) als auch bei einer DC-Bestimmungsmethode (2) zum Oxidationsschutz der Substanzen Ascorbinsäure eingesetzt wurde. Eigene Untersuchungen haben gezeigt, dass die Stabilität der Haarfarben bei Einsatz von Natriumsulfit höher ist. Bei Creme-Haarfarben führt der Einsatz eines Ultraschallhomogenisators dazu, in kurzer Zeit homogene, leicht membranfiltrierbare Extrakte für die unmittelbar anschließende HPLC zu erzielen. Mit dem Prüfverfahren können momentan 33 Haarfarben über Retentionszeit und UV-Spektrum identifiziert und bestimmt werden. Weitere Referenzsubstanzen werden analysiert; angesichts der über 100 Haarfarben, die künftig zugelassen werden, und der Fülle an verbotenen Stoffen wird eine parallele Bestimmung aller Substanzen in einem Lauf sicher nicht gelingen. Nähere Informationen über Haarfarben finden Sie im Kapitel 3.

Probenaufarbeitung und Kalibrierlösungen

  • Ca. 0,5 g Probe werden auf 0,1 mg genau in ein Becherglas (i.d.R. 50 ml) eingewogen.
  • Nach Zugabe von höchstens 20 ml Reduktionspuffer (s.u.) wird ca 1 min ultraschallhomogenisiert.
  • Überführung in einen 50?ml Messkolben (braun).
  • Nachspülen und Auffüllen mit Acetonitril. Stickstoffbegasung.
  • Filtrieren über Faltenfilter und Membranfilter (0,2?µm Porengröße) in Vial (braun) zur HPLC-Messung.
  • zusätzlich Verdünnung 1:10: 1 ml Probenlösung/10 ml Verdünnungspuffer, Stickstoffbegasung, membranfiltrieren, abfüllen zur HPLC-Messung.
  • Referenz-Stammlösung: 25 mg (auf 0,1 mg genau) in 25 ml Messkolben (braun) einwiegen. Lösen mit ca 15 ml Reduktionspuffer (s.u.), ggf. mit Hilfe Ultraschallbad. Aufgefüllt wird mit Acetonitril. Konzentration: 1 mg/ml
  • Diese Lösung nach Stickstoffbegasung lichtgeschützt und gekühlt aufbewahren oder für HPLC verwenden.
  • Einpunktkalibrierung: 100?µg/ml, Verdünnung der Stammlösung 1:10 mit Verdünnungspuffer
  • Nach Stickstoffbegasung lichtgeschützt aufbewahren oder direkt zur HPLC-Messung, immer Doppelabfüllungen für Anfang und Ende der Sequenz.
  • Zusätzliche Kalibrierlösungen (bei auffälligen Befunden)
    • 10 µg/ml : Stammlösung 1:100 verdünnt mit Verdünnungspuffer
    • 25 µg/ml: Stammlösung 1:40 verdünnt
    • 50µg/ml: Stammlösung 1:20 verdünnt

Chemikalien und Reagentien

  • Stickstoff zur Begasung
  • Salzsäure (HCl) konz, 37?%, HPLC-geeignet
  • Borax, Dinatriumtetraborat-Decahydrat (Na2B4O7×10 H2O), M=381,37 g/mol
  • 0,1 M HCl (3,66 ml HCl conc in 440 ml H2O)
  • 0,05 M Borax-Lösung (10,68 g Borax in 560 ml H2O)
  • Sörensen-Puffer pH=8,0: 440 ml 0,1 M HCl und 560 ml 0,05 M Borax-Lösung auf pH=8,0 (überprüfen bzw. tropfenweise einstellen mit HCl conc)
  • Natriumsulfit
  • Reduktionspuffer: 500 mg Natriumsulfit in 100 ml Sörensen-Puffer
  • Acetonitril, HPLC-geeignet
  • Verdünnungspuffer: 50 ml Reduktionspuffer und 50 ml Acetonitril für die HPLC
  • Reinstwasser, HPLC-taugliche Reinheit, z.B. SeralPur
  • Essigsäure konz, (HAc) (Eisessig) 100%, HPLC-geeignet
  • Ammoniak (NH3), konz
  • 10% NH3-Lösung
  • 0,02 M HAc (1,14 g HAc konz auf 1000 ml H2O)
  • HPLC-Eluent A: 0,02 M HAc mit 10% NH3-Lösung auf pH=5,9
  • HPLC-Eluent B: Acetonitril, HPLC-geeignet + 0,5% Reinstwasser

Geräte/Hilfsmittel

  • Ultraschallhomogenisator, z.B. von Vibracell
  • Membranfilter mit 0,2 µm Porengröße
  • Vakuumfiltrationsgerät
  • Rollrandgläser (=Vial) (Braunglas) mit passenden Bördelkappen, geeignet für automatischen HPLC-Probengeber

HPLC-Bedingungen

  • Hochleistungsflüssigkeitschromatograph, bestehend aus einem binären Pumpensystem, automatischem Probengeber, heizbarem Säulenraum, Dioden-Array-Detektor (DAD), Auswertesystem
  • Vorsäule 20 mm × 2,1 mm Hypersil ODS 5 µm (Agilent)
  • Hauptsäule Purospher Star RP-18, 5 µm, 250 mm × 2 mm (Merck)
  • Injektionsmenge: 2 ml
  • Flow: 0,2ml/min

Auswertung

  • Die Identifizierung der Einzelstoffe erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten der zu analysierenden Substanzen in der Probe mit denjenigen der Referenzsubstanzen.
  • Ist ein ausreichendes Signal vorhanden, müssen die UV/VIS-Spektren des Peaks mit dem Bibliotheksspektrum übereinstimmen.
  • Die quantitative Bestimmung erfolgt nach der Methode des externen Standards durch Integration der Peakflächen oder durch Ermittlung der Peakhöhen.
  • I.d.R. wird lediglich eine Einpunktkalibrierung mit dem Standard 100 µg/ml durchgeführt.
  • Bei Gehalten im Bereich des Grenzwertes werden Mehrpunktkalibrierungen nachgezogen.

Die Grenzwerte in der Kosmetikverordnung beziehen sich i.d.R. auf die 1+1-Mischung Farbstoffkomponente mit Entwickleremulsion (Wasserstoffperoxid-Komponente). Daher ist es wichtig, die Herstellerangabe (i.d.R. Informationsblatt) zur Mischung des für die Haarfärbung bestimmten Endproduktes zu berücksichtigen.

Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen

  • Die Entwickler und Kuppler sind lichtempfindlich. Daher immer ohne Deckenbeleuchtung arbeiten, intensive Sonneneinstrahlung unbedingt vermeiden.
  • Die Entwickler und Kuppler sind sehr sauerstoffempfindlich. Zügig arbeiten und nach Beschreibung mit Stickstoff begasen.
  • Zur HPLC immer nur in Glasvials abfüllen. Keine Kunststoff-Vials verwenden, da z.T. erheblicher Substanzverlust bei Verwendung konischer Kunststoffvials festgestellt wurde.
  • Bisherige Erfahrungswerte haben gezeigt, dass die Stammlösungen mindestens zehn Tage stabil bleiben, eingefroren in Braunglasvials oder in Braunschraubglasgefäßen. Die Kalibrierlösungen sollten meßtäglich hergestellt werden.
  • Referenz-Mixe sollten möglichst nur Entwicklersubstanzen bzw. Kuppler enthalten; Kombinationen aus Kupplern und Entwicklern können schneller miteinander reagieren als nur Entwickler bzw. Kuppler in den Mix-Lösungen.
Retentionszeiten der 33 Haarfarben
INCI-Name Retentionszeit in min Mix
p-PHENYLENEDIAMINE 3,36 C
2-AMINOMETHYL-p-AMINOPHENOL HCl 3,448 D
p-AMINOPHENOL 4,00 A
DIAMINOPHENOXYETHANOL HCl 4,898 B
m-PHENYLENEDIAMINE 4,95 Einzel
TOLUENE-2,5-DIAMINE (m) 5,03 C
m-AMINOPHENOL 5,638 A
4-AMINO-m-CRESOL 5,80 B
N.N-Dimethyl2,6-pyridinediamin (nicht sicher) 6,04 E
RESORCINOL 6,48 A
2-AMINO-3-HYDROXYPYRIDINE 6,50 C
p-METHYLAMINOPHENOL 6,86 B
o-AMINOPHENOL 7,11 C
2-METHYLRESORCINOL 7,26 A
2-AMINO-4-HYDROXYETHYLAMINOANISOLE 7,47 B
2-NITRO-p-PHENYLENEDIAMINE 7,50 Einzel
HYDROXYBENZOMORPHOLINE 7,73 Einzel
4-AMINO-2-HYDROXYTOLUENE 8,60 A
2-HYDROXYETHYL PICRAMIC ACID 8,639 D
4-AMINO-3-NITROPHENOL 8,69 F
HC BLUE NO. 2 8,74 G
2-AMINO-6-CHLORO-4-NITROPHENOL 8,86 E
1,3-BIS-(2,4-DIAMINOPHENOXY)PROPANE 9,49 D
HC YELLOW NO. 5 9,75 F
4-HYDROXYPROPYLAMINO-3-NITROPHENOL 9,95 G
4-CHLORORESORCINOL 10,41 D
1,5-NAPHTHALENEDIOL 11,11 F
2,7-NAPHTHALENEDIOL 11,28 G
PHENYL METHYL PYRAZOLONE 11,33 B
HYDROXYETHYL-2-NITRO-p-TOLUIDINE 14,55 D
DISPERSE VIOLET 1 15,26 E
HC YELLOW NO. 12 15,33 F
1-NAPHTHOL 16,08 A

LITERATUR
1) J.W.Weyland, Rooselaar, HPLC of oxidative hair dye analysis, Separation and stability testing, J.Liq.Chrom.Rel. Technol. 21, 883-901 (1988).
2) H.Gottschalk, R.Machens, Identifizierung und quantitative Bestimmung von Oxidations-farbstoffen in Haarfärbemitteln, J.Soc. Cosm. 33, 97-114 (1982).
3) E. Vogt, G. Mildau, M. Metzler, Lebensmittelchemie 57, 156-157 (2003)

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